Descalcificación de Edta
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La descalcificación describe la técnica para eliminar los minerales del hueso o de otros tejidos calcificados, de modo que se puedan preparar secciones de parafina de buena calidad que conserven todos los elementos microscópicos esenciales. La descalcificación se lleva a cabo después de que la muestra haya sido fijada completamente y antes del procesamiento rutinario en parafina. En este artículo se describe la estructura básica del hueso y se describen las opciones técnicas para la preparación de secciones. Se discute el procedimiento de descalcificación y el seguimiento exitoso del proceso y se proporcionan algunas opciones populares para la elección de reactivos.
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Hay varias opciones disponibles cuando el histólogo debe producir secciones de muestras óseas u otras muestras calcificadas. A la hora de elegir una técnica y un método de procesamiento, hay que tener en cuenta el tipo de investigación que se está llevando a cabo. Por ejemplo, si se investiga una enfermedad ósea metabólica y es necesario diferenciar el hueso mineralizado del osteoide, o si se requieren mediciones morfométricas, puede ser necesario conservar y demostrar el contenido mineral produciendo secciones de hueso no descalcificado. Como el hueso mineralizado es un material tan duro, hay una gama limitada de técnicas disponibles para producir secciones de él. Después de la fijación, se puede aserrar directamente en obleas finas y, a continuación, molerlas utilizando superficies abrasivas para producir secciones finas “molidas” (véase la figura 1). También es posible preparar muestras de hueso infiltrándolas con resinas acrílicas o epoxídicas, que al polimerizarse tienen una dureza equivalente a la del hueso mineralizado. A continuación, se pueden realizar secciones esmeriladas de las muestras infiltradas o seccionarlas directamente utilizando un micrótomo de alta resistencia (como el Leica SM2500) y un cuchillo de carburo de tungsteno o de diamante (véase la figura 2). Otra posibilidad son las secciones congeladas de hueso esponjoso mineralizado.1-3
Protocolo de histología ósea
El hueso se considera el tejido de soporte más importante del cuerpo. Está compuesto por células, matriz extracelular orgánica y sales inorgánicas. El tejido óseo está mineralizado en capas que proporcionan gran resistencia y flexibilidad al sistema esquelético. Su formación varía, dependiendo de su función, en todo el cuerpo. Estas diferencias funcionales/de formación se basan también en la proporción de los diferentes procesos inorgánicos y orgánicos que se incorporan o producen en la formación de un hueso. El mineral más común en el hueso es la hidroxiapatita, que está formada por colágeno, proteínas e iones de carbonato. El grueso del hueso es aproximadamente un 70% de minerales y un 30% de componentes orgánicos en peso. Las células óseas, a diferencia de las de la médula, son relativamente escasas. En este capítulo se revisará la morfología del hueso y sus componentes orgánicos e inorgánicos, además de considerar los métodos de preparación de secciones de hueso para su análisis que pueden utilizarse en los laboratorios de histología clínicos y de investigación.
En el esqueleto humano adulto pueden reconocerse macroscópicamente dos tipos de hueso. Se trata del hueso cortical o compacto y del hueso trabecular, esponjoso o de baja densidad. El hueso compacto es el hueso sólido, duro e inmensamente fuerte que forma los ejes de los huesos largos (por ejemplo, el fémur y la tibia) y las superficies exteriores de los huesos planos (por ejemplo, las costillas y el cráneo). El hueso trabecular se encuentra en la diáfisis, la epífisis y las cavidades medulares de los huesos largos, las vértebras y los centros de los huesos planos. Se trata de una malla de filamentos óseos de aproximadamente 1 mm de grosor. Aunque parece menos sólido que el hueso cortical, esta disposición de trabéculas, sobre todo en la cabeza del fémur y las vértebras, donde forma una estructura de soporte de peso casi ideal, es muy resistente.
Procedimiento de descalcificación
La descalcificación ósea es el reblandecimiento de los huesos debido a la eliminación de los iones de calcio, y puede realizarse como técnica histológica para estudiar los huesos y extraer el ADN.[1][2] Este proceso también se produce de forma natural durante el desarrollo y el crecimiento de los huesos, y cuando no se inhibe, puede causar enfermedades como la osteomalacia.[3]
Dado que los huesos ricos en calcio son muy difíciles de estudiar, los científicos utilizan la descalcificación ósea para disponer de especímenes para sus investigaciones[4]. Por ejemplo, la descalcificación ósea se ha utilizado para examinar los niveles de cartílago y magnesio con el fin de comprender el deterioro de los huesos[1] Existen dos categorías de agentes descalcificadores para eliminar los iones de calcio: los agentes quelantes y los ácidos. Los ácidos se dividen a su vez en débiles (ácido pícrico, acético y fórmico) y fuertes (ácido nítrico y clorhídrico). Los ácidos ayudan a producir una solución de iones de calcio, mientras que los agentes quelantes absorben los iones de calcio. El agente quelante más utilizado es el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). La descalcificación es un procedimiento largo, ya que los trozos de hueso deben dejarse en el agente descalcificador durante días o semanas, dependiendo del tamaño del hueso. Existen numerosos métodos para comprobar cuándo se ha completado la descalcificación del hueso, como el examen radiológico, el análisis químico y la medición de la flexibilidad de la muestra. La descalcificación es necesaria para obtener secciones blandas del hueso utilizando un microtomo. Todas las secciones finas del hueso que se cortan pueden procesarse (véase el procesamiento de tejidos) como cualquier otro tejido blando del cuerpo.
Protocolo de descalcificación de la médula ósea
Todo tejido que contenga hueso, dientes o calcificaciones debe estar TOTALMENTE FIJADO antes de la descalcificación. La descalcificación debe realizarse de tal manera que el tejido pueda ser seccionado en la sala de bruto con una cuchilla y/o en histología con un micrótomo. Los fragmentos óseos escasos (como en los márgenes de la médula) pueden congelarse en fresco (sin descalcificación) siempre que sean pequeños y puedan cortarse con el criostato. Los materiales no orgánicos como el cemento óseo, los empastes dentales o los metales NO se descalcifican y NO deben presentarse en cassettes.
Cualquier tejido duro para el que puedan necesitarse pruebas moleculares (NGS, FISH, etc.) NO debe descalcificarse en ácido (HCl). Debe descalcificarse con un descalcificador suave (EDTA). Por favor, pregunte a un AP si necesita EDTA.
